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Maladie ou toxicité ?

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Re: Maladie ou toxicité ?

Message par Petro91 » 02 Oct 2020, 08:45

JeromeB a écrit:Merci d’avoir passé du temps à rédiger une synthèse aussi claire.
Oui. Merci.
Un peu de théorie dans ce monde de pratique, exclusive, parfois mal digérée. :wink:
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Re: Maladie ou toxicité ?

Message par Petro91 » 02 Oct 2020, 08:53

Pat41200 a écrit:Je suus désolé mais je jette l'éponge vous confondez aérobies et anaérobies
Non, précisément, il n'y a aucune confusion.
Toute la question d'utiliser les bactéries et leur fonction à notre avantage, pas d'en souffrir.

Le souci avec nos démonstrations est que chacun se propose en modèle sans définir les besoins de base qu'il a eu à solutionner.
Dans un petit bac, la problématique poissons/pollution est essentielle.

Dans la discussion qui nous anime reste un bac de 13M3 ... donc beaucoup d'eau, un décor très présent, beaucoup de sable et peu de poissons.
C'est une situation peu commune.
Eric
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Re: Maladie ou toxicité ?

Message par Pat41200 » 02 Oct 2020, 08:57

Si l'exposé de Jerome est clair une chose est sur que les bactéries aérobies vivent dans le flux d'eau que ce soit dans l'aquarium ou dans le filtre elles vivent dans le flux, toute eau qui traverse les masses de filtration est un flux !! sur le reste on est d'accords quand au 2 % pour la dénitrification je ne peux que être très sceptique
Je vais me rapprocher de la société IET-AQUARESEARCH LTD avec qui j'ai travaillé pendant 10 ans au canada et qui sont des chercheurs reconnue en la matière et les interrogé , pour votre gouverne ils sont spécialisé dans ce genre de bactéries

IET-Aquaresearch Ltd fournit des communautés de bactéries bénéfiques ECOPROBIOTICS® la croissance, le conditionnement et l’ajout de cultures actives, non dormantes bactéries. Le système est utilisé pour le contrôle de la graisse et des causes des odeurs dans les pièges/intercepteurs de graisse, la station de levage, les égouts, pour la réduction des boues sur place, l’optimisation du traitement des eaux usées (élimination des déchets, nitrification/dénitrification), le traitement industriel et lixiviat des eaux usées (enlèvement des hydrocarbures et de l’ammoniac), l’amélioration de la qualité de l’eau en aquaculture.

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Re: Maladie ou toxicité ?

Message par Petro91 » 02 Oct 2020, 09:07

philippe.hotton a écrit:Eric, FAUX et VRAI

FAUX : le sable est très utile parce que la majorité des bactéries sont dans le sable (j'avais lu il y a très longtemps un rapport de 90% dans le sable et 10% dans le filtre).
Oui, il est utile, personne n'en doute mais reprend attentivement la théorie de Jérôme (Biodivmax).
Le sable fonctionne en anaérobie et les mousses (propres et eau circulante) travaillent en aérobie.

Dans un bac, nous sommes toujours sur le fil du rasoir car les équilibres sont précaires par manque de volume. Plus un bac est petit, plus l'équilibre est compliqué à tenir, d'où les changements d'eau nombreux.
Dans ce bac, nous ne devrions pas avoir ce genre de souci. D'où le peut être, trop de sable et son souci de lavage de base ... méthanisation possible !!
La sable peut fonctionner mais alors peuplés de beaucoup d'escargots pour le transformer en masse vivante et bénéfique.
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Re: Maladie ou toxicité ?

Message par philippe.hotton » 02 Oct 2020, 10:45

Tout à fait d'accord avec toi.

Un peu de lecture : https://ivanov.ch/cycle-de-lazote-nitrates-phosphates/
C'est toujours bien de reprendre les bases

:D
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Re: Maladie ou toxicité ?

Message par Pat41200 » 02 Oct 2020, 12:34

philippe.hotton a écrit:Tout à fait d'accord avec toi.

Un peu de lecture : https://ivanov.ch/cycle-de-lazote-nitrates-phosphates/
C'est toujours bien de reprendre les bases

:D


Heureusement qu'il y a d'autres méthode pour pouvoir mettre en route un bac et introduire ces poissons plus rapidement
Pour mon compte je mets mon bac en route et les poissons intègre le bac 24 h après le temps de laissé le chlore ce dissoudre
et je ne subit aucune montée de nitrites, enfin juste une fois et j'y es remédier aussitôt au bout de 24 heures cela était descendu de moitié au bout de 72 heures j'était à zéro

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Re: Maladie ou toxicité ?

Message par philippe.hotton » 02 Oct 2020, 12:45

Pat41200 a écrit:
philippe.hotton a écrit:Tout à fait d'accord avec toi.

Un peu de lecture : https://ivanov.ch/cycle-de-lazote-nitrates-phosphates/
C'est toujours bien de reprendre les bases

:D


Heureusement qu'il y a d'autres méthode pour pouvoir mettre en route un bac et introduire ces poissons plus rapidement
Pour mon compte je mets mon bac en route et les poissons intègre le bac 24 h après le temps de laissé le chlore ce dissoudre
et je ne subit aucune montée de nitrites, enfin juste une fois et j'y es remédier aussitôt au bout de 24 heures cela était descendu de moitié au bout de 72 heures j'était à zéro


Pareil.
Mais les bases restent les bases
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Re: Maladie ou toxicité ?

Message par Petro91 » 04 Oct 2020, 10:38

philippe.hotton a écrit:Tout à fait d'accord avec toi.
J'aime quand tu me parles comme ça .... :aime2:
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Re: Maladie ou toxicité ?

Message par biodivmax » 04 Oct 2020, 13:16

J'ai regardé un peu si on avait des publications sur les bactéries présentes dans les aquariums, mais c'est assez flou, et restreint aux techniques d'aquaculture ou aux risques sur la santé publique.
En tout cas, il est clair que de nombreux taxons présents sont aero-anaérobies facultatifs, et donc peuvent exploiter les dérivés azotés soit à l'aide d'oxygène soit à l'aide de sucres si l'oxygène manque. Donc une gradation se crée dans les profondeurs du substrat, et les mêmes bactéries peuvent utiliser des chemins enzymatiques différents selon leur position dans le substrat, et donc produire des substances chimiques différentes.

Pour les populations bactériennes, j'ai çà:
"Communautés microbiennes associées aux matériaux filtrants dans les systèmes d'aquaculture en recirculation de poissons d'eau douce
Panneau de superposition ouvert des liens auteurHaruo Sugita Hiroshi Nakamura Taku Shimada
https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2 ... 028Obtenez des droits et du contenu
Abstrait
Les communautés microbiennes associées aux matériaux filtrants dans des systèmes fermés à recirculation de carpes et de poissons rouges ont été examinées par la méthode de bibliothèque de clones du gène de l'ARNr 16S. Les cellules bactériennes ont été efficacement récupérées par la combinaison de six traitements de lavage et d'un écouvillonnage. La densité bactérienne sur les cailloux des systèmes d'eau de recirculation bien conditionnés était de 1,1 × 10 7 cellules g −1 dans le bac d'élevage de carpes et de 1,9 × 10 8 cellules g −1dans l'aquarium d'élevage de poissons rouges. Les 91 séquences d'ADNr clonées étaient occupées par des membres au sein d'Alphaproteobacteria (52 clones appartenant à 19 taxons), Betaproteobacteria (14 clones appartenant à 8 taxons), Nitrospira (8 clones appartenant à 1 taxon), Actinobacteria (6 clones appartenant à 4 taxa), Bacilli (3 clones appartenant à 3 taxons), Gammaproteobacteria (3 clones appartenant à 3 taxons), Planctomycetacia (3 clones appartenant à 3 taxons) et Sphingobacteria (2 clones appartenant à 1 taxon). Cependant, seuls trois taxons, qui sont étroitement liés à Hyphomicrobium denitrificans , Rhodovulum euryhalinum et Nitrospira moscoviensis, ont été couramment détectés dans les systèmes d'élevage de carpes et de poissons rouges. Ces résultats révèlent qu'il existe de grandes différences à la fois dans la densité et la composition bactériennes entre les deux systèmes différents, et que la bibliothèque de clones construite à partir d'un bassin d'élevage de carpes est caractérisée par jusqu'à 29 taxons de bactéries et que ceux de l'aquarium d'élevage de poissons rouges. est caractérisé par Hyphomicrobium facilis avec une occurrence de 42%. Ces résultats signifient qu'au moins 36% du total des clones pourraient utiliser l'azote inorganique, NH 4 + , NO 2 - ou NO 3 - , suggérant qu'ils concernent la dynamique de l'azote dans les installations d'élevage de poissons équipées du système de recirculation."

ou çà:
"Diversité microbienne et agents pathogènes potentiels dans l'eau des aquariums de poissons d'ornement
Katherine F.Smith , 1 Victor Schmidt , 1, 2 Gail E. Rosen , 1, 3 et Linda Amaral-Zettler 2, 4, *
Dario S. Zamboni, éditeur
Informations sur l' auteur Notes sur l' article Informations sur les droits d'auteur et la licence Avis de non-responsabilité
Cet article a été cité par d' autres articles de PMC.
Données associées
Matériel supplémentaire
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Abstrait
Les poissons d'ornement font partie des catégories d'animaux de compagnie les plus populaires et les plus dynamiques aux États-Unis. La portée et l'échelle mondiales du commerce des poissons d'ornement et la popularité croissante des poissons de compagnie aux États-Unis sont de bons indicateurs de la myriade d'avantages économiques et sociaux fournis par l'industrie des animaux de compagnie. On en sait relativement peu sur les communautés microbiennes associées à ces poissons d'ornement ou sur l'eau d'aquarium dans laquelle ils sont transportés et logés. En utilisant des approches moléculaires conventionnelles et un séquençage amplicon à haut débit de nouvelle génération de régions hypervariables du gène de l'ARN ribosomal 16S, nous avons caractérisé la communauté bactérienne de l'eau d'aquarium contenant des poissons rouges communs ( Carassius auratus ) et des mangeurs d'algues chinoises ( Gyrinocheilus aymonieri) acheté dans sept magasins pour animaux de compagnie / aquariophilie du Rhode Island et a identifié la présence d'agents pathogènes potentiels. Notre enquête a identifié un total de 30 phylums, les plus courants étant les protéobactéries (52%), les bactéroïdes (18%) et les planctomycètes (6%), les quatre premiers phylums représentant plus de 80% de toutes les séquences. Les séquences de nos échantillons d'eau étaient les plus étroitement liées à onze espèces bactériennes susceptibles de provoquer des maladies chez les poissons, les humains et d'autres espèces: Coxiella burnetii, Flavobacterium columnare, Legionella birminghamensis, L. pneumophila, Vibrio cholerae , V. mimicus . V. vulnificus, Aeromonas schubertii , A. veronii , A. hydrophila et Plesiomonas shigelloides. Nos résultats, combinés aux preuves de la littérature, suggèrent que l'eau des aquariums abritant des poissons d'ornement est une source peu étudiée pour les nouvelles communautés microbiennes et les agents pathogènes qui posent des risques potentiels pour l'industrie des animaux de compagnie, les poissons dans le commerce, les humains et d'autres espèces.

Aller à:
introduction
Les poissons ornementaux sont aujourd'hui le troisième groupe d'animaux de compagnie le plus répandu dans les foyers des États-Unis. L'enquête 2011-2012 de l'American Pet Products Manufacturers Association a rapporté que 62% des ménages américains (73 millions de foyers) possèdent un animal de compagnie. Parmi ceux-ci, 17% possèdent des poissons d'aquarium ornementaux, totalisant 73 millions de maisons avec plus de 151,1 millions de poissons d'eau douce et 8,61 millions de poissons d'eau salée. Au cours de la dernière décennie, les poissons ont été l'une des catégories d'animaux de compagnie à la croissance la plus rapide aux États-Unis, avec une augmentation de plus de 20% du nombre de propriétaires au cours de la décennie précédente [1] . Les poissons ornementaux vendus dans le pays sont à la fois élevés dans le pays et importés de l'étranger [2] , [3]. Plus de 90% des espèces sauvages vivantes non domestiquées importées aux États-Unis au cours de la période 2000-2006 étaient des poissons d'ornement d'eau douce et marins, originaires en grande partie d'Asie du Sud-Est et totalisant 1,1 milliard d'individus. En moyenne, 18 000 expéditions et 187 millions de poissons d'aquarium vivants étaient importés chaque année, dont 99% étaient destinés à la vente commerciale dans l'industrie des animaux de compagnie.

L'industrie des animaux de compagnie offre de nombreux avantages économiques et sociaux et la portée mondiale, l'échelle et la popularité croissante du commerce des poissons d'ornement en sont la preuve. Des résultats imprévus peuvent toutefois se produire, notamment la propagation d'agents pathogènes potentiels susceptibles de provoquer des maladies chez les animaux commerciaux eux-mêmes ou chez d'autres hôtes sensibles rencontrés dans les chaînes d'approvisionnement, dans les animaleries ou dans les aquariums de destination finale. En particulier, l'eau de transport et de réservoir d'aquarium associée aux poissons d'ornement fournit les conditions de choix pour la croissance bactérienne; la plupart des poissons commercialisés sont d'origine tropicale [2]et nécessitent les mêmes environnements chauds, riches en nutriments et aérés qui favorisent la croissance bactérienne. À ce jour, très peu d'études ont caractérisé l'ensemble des communautés microbiennes ou des agents pathogènes potentiels associés aux poissons d'ornement ou à leur eau [4] - [6] . C'était le principal objectif de notre étude.

De nouvelles stratégies moléculaires introduites par un effort international de recensement de la vie marine [7] - [10] ont permis de caractériser rapidement et à moindre coût les communautés microbiennes dans une gamme d'habitats au-delà du milieu marin, y compris les microbiomes humains [11] - [13] , celles d'autres animaux [14] , [15] et les environnements à fort impact humain tels que les eaux usées et l'air urbain [16] , [17] . Comme les humains, les poissons d'ornement devraient posséder un ordre de grandeur plus de cellules microbiennes que de cellules de poisson dans leur corps [18]. La caractérisation des communautés microbiennes et des taxons pathogènes associés au commerce des poissons d'ornement profiterait largement à l'industrie de l'aquarium, à l'aquaculture et aux responsables de la santé publique concernés par les infections bactériennes opportunistes dans les populations compromises. En utilisant une combinaison d'approches moléculaires traditionnelles et de séquençage d'amplicon à haut débit de nouvelle génération de régions hypervariables du gène de l'ARN ribosomal 16S, nous rapportons les résultats d'une enquête sur la composition de la communauté bactérienne, une enquête plus ciblée sur Vibrioet la composition des espèces gamma-protéobactériennes, et des agents pathogènes potentiels spécifiques trouvés dans l'eau des aquariums de poissons d'ornement dans sept magasins pour animaux de compagnie / aquariophilie du Rhode Island. À notre connaissance, il s'agit de la première étude à utiliser des méthodes de séquençage à haut débit pour caractériser la communauté microbienne associée à l'eau d'aquarium des poissons d'ornement dans l'industrie des animaux de compagnie.

Aller à:
Résultats
Diversité microbienne
Notre séquençage des régions hypervariables bactériennes V3 – V5 du gène de l'ARNr 16S à partir de deux échantillons d'aquarium, chacun dans trois magasins pour animaux de compagnie / aquarium, a généré un total de 64 757 lectures (moyenne de 10 792 par échantillon, plage de 6 934 à 14 295). Nous avons séquencé les mêmes six échantillons, plus un échantillon supplémentaire d'un 4 ème magasin, en utilisant des amorces ciblant les Vibrio espèces couvrant la région hypervariable V4 qui produit un 44.713 supplémentaire ARNr 16S amplicon du gène lit (moyenne 7452) (par exempleTableau 1). Ces dernières amorces combinaient une amorce générale directe (518F) avec une amorce inverse spécifique à Vibrio et avaient l'avantage de récupérer les deux espèces de Vibrio , ainsi que d'autres membres des gammaproteobacteria connus pour abriter des espèces potentiellement pathogènes.

Tableau 1
Échantillons prélevés dans des sacs d'eau abritant Carassius auratus (poisson rouge commun) ou Gyrinocheilus aymonieri (mangeur d'algues chinois), achetés auprès de quatre animaleries du Rhode Island, et résultats associés.
Informations sur la collecte des échantillons 341F-926R (V3 – V5) Amplicon Run * 518F-680R (V4) Amplicon Run *
Nom de l'échantillon ** Espèces cibles Autres espèces dans le réservoir Non cible / Non. autre Non lit Obs. OTU Non lit Obs. OTU
A1 C. auratus Siluriformes sp. 19/3 9232 1312 6938 26
A2 G. aymonieri Macropodus opercularis 14/42 11221 1664 7096 14
Danio rerio
Ancistrus sp.
D1 C. auratus Aucun 10/0 10268 580 7565 33
D2 G. aymonieri Paracheirodon innesi 10/20 6934 380 7599 29
E1 C. auratus Hemigrammus ocellifer 10/1 12807 917 7051 30
E2 G. aymonieri Poecilia reticulata 2/14 14295 1242 8464 61
Corydoras sp.
Misgurnus anguillicaudatus
B2 G. aymonieri Aucun 10/0 N / A N / A 8202 44
* Les amorces 341F-926R ont été conçues pour capturer la diversité bactérienne globale, tandis que les amorces 518F-680R ont été conçues spécifiquement pour capturer la diversité Vibrio .
** Les exemples de noms consistent en une lettre d'identification du magasin, suivie du numéro de l'échantillon prélevé dans ce magasin. Un seul échantillon existe du magasin B qui a été inclus uniquement sur l' analyse d'amplicon ciblée 518F-680R Vibrio .
L'analyse taxonomique des lectures d'amplicon du gène ARNr V3 – V5 16S a donné un total de 30 phylums dans tous les échantillons avec les deux plus abondantes, les protéobactéries (moyenne 51,8%) et les bactériodètes (moyenne 17,6%), représentant près de 70% de toutes les lectures. Plusieurs phylums étaient extrêmement rares. Elusimicrobia, Deferribacteres et Tenericutes ne contenaient qu'une seule lecture (<0,01%), et WS3, SR1 et TAO6 contenaient moins de 10 lectures chacun (<0,03%), bien qu'ils soient présents dans plusieurs échantillons (Figure 1).

Un fichier externe contenant une image, une illustration, etc. Le nom de l'objet est pone.0039971.g001.jpg
Figure 1
Diversité bactérienne au niveau du phylum.
Diversité bactérienne au niveau de l'embranchement telle que révélée par le séquençage par pyrotag de la région hypervariable V3 – V5 des gènes d'ARNr 16S dans nos échantillons d'étude (Tableau 1). Trente phylums ont été détectés. A ) Fréquence relative des phylums en proportion du total des étiquettes. La variance inter-magasins de la fréquence relative est représentée par la couleur pour les deux phylums les plus abondants, les protéobactéries et les bactéroïdes, représentant environ 70% de toutes les séquences. B ) Variance inter-magasins de la fréquence relative pour les phylums restants (<30% du total des lectures) normalisée à 100% après soustraction des protéobactéries et des bactériodètes.

La diversité alpha (au sein de la diversité de l'échantillon) basée sur l'estimation de la richesse en espèces de notre séquençage d'amplicon du gène ARNr V3-V5 différait considérablement et était plus élevée entre le magasin A et les deux magasins D et E, mais pas entre les magasins D et E. Analyses utilisant les deux méthodes basées sur la phylogénie métriques (Phylogenetic Diversity (PD) Whole Tree) telles qu'implémentées dans Qiime v1.4.0 [19] et la richesse paramétrique basée sur un modèle estimée à l'aide du programme CatchAll [20] ont montré des tendances similaires de richesse comparative entre les magasins (Figure 2). Les estimations des prises Toutes du magasin A étaient les plus élevées avec 9130 espèces estimées, suivies du magasin E avec 5308 et du magasin D avec 1414 espèces estimées (Figure 2). Même en utilisant la limite de confiance la plus basse pour le magasin A (LB = 6 494) et la limite supérieure pour le magasin D (UB 1 650), cela représentait une différence près de quatre fois dans la diversité bactérienne entre les magasins. Nous n'avons trouvé aucune différence significative dans la diversité alpha lorsque les échantillons étaient regroupés en fonction des espèces de poissons dominantes occupant les bassins à partir desquels les échantillons ont été prélevés (données non présentées), ce qui suggère que la variation entre les magasins avait un effet plus fort sur la diversité bactérienne que les espèces de poissons.

Un fichier externe contenant une image, une illustration, etc. Le nom de l'objet est pone.0039971.g002.jpg
Figure 2
Diversité Alpha dans les animaleries.
Diversité alpha au sein des magasins de détail basée sur A ) l'analyse du meilleur modèle de CatchAll avec des données non raréfiées présentées avec des limites de confiance supérieures et inférieures corrigées par Bonferroni à 95% pour chaque estimation. B ) Diversité phylogénétique (PD) - Analyse de l'arbre entier calculée après raréfaction des échantillons à une profondeur de séquençage égale dans QIIME. Les deux mesures ont été appliquées pour calculer la diversité alpha entre les magasins en regroupant 2 échantillons de chaque magasin pour une seule analyse.

Les métriques de diversité bêta ont également montré des regroupements forts d'échantillons prélevés dans le même magasin mais n'étaient pas statistiquement significatifs (ANOSIM, p = 0,067). Les distances UNIFRAC [21] (une mesure phylogénique indépendante de la taxonomie) entre les échantillons dans un magasin étaient toujours plus petites que toutes les comparaisons entre magasins, et l'analyse PCA de ces distances a montré que les échantillons de chaque magasin étaient regroupés (figure 3). Cette tendance était également évidente en utilisant les méthodes de distance basées sur l'abondance OTU, et un certain degré de regroupement était évident avec le Bray-Curtis (données non présentées) et Morisita-Horn (figure 3), bien que les regroupements entre les magasins A et D se soient effondrés en utilisant Morisita-Horn (figure 3). Ces différences sont potentiellement dues à l'hétérogénéité de la profondeur de séquence entre les échantillons (magasin A: 20 295, magasin D: 16 903, magasin E: 27 016).

Un fichier externe contenant une image, une illustration, etc. Le nom de l'objet est pone.0039971.g003.jpg
figure 3
Diversité bêta entre les échantillons.
Diversité bêta entre les échantillons basée sur A ) les métriques de similarité Morisita-Horn des données non raréfiées visualisées à l'aide de l'échelle multidimensionnelle non métrique (NMDS). B ) Distance UNIFRAC illimitée calculée après avoir raréfié des échantillons à une profondeur de séquence égale dans QIIME, visualisée à l'aide de l'analyse en composantes principales.

Dépistage par PCR et clonage d'agents pathogènes potentiels
Nous avons testé la présence directe de 12 agents pathogènes potentiels bactériens ou eucaryotes connus dans les échantillons des sept magasins en utilisant des ensembles d'amorces spécifiques. Cinq des douze genres (42%) n'ont été détectés dans aucun de nos échantillons: Salmonella , Giardia, Naegleria , Francisella et Campylobacter. L'acanthamoeba , une amibe pathogène opportuniste vivant librement abritant souvent des bactéries symbiotiques potentiellement pathogènes, était omniprésente dans tous les échantillons testés (N = 10). Les genres Vibrio, Legionella et Mycobacterium ont tous été trouvés dans au moins 10 des 14 réservoirs dans lesquels nous avons prélevé des échantillons, tandis que Cryptosporidium, Corynebacterineae et Aeromonas ont été moins fréquemment détectés (dans 3, 7 et 7 réservoirs respectivement).

Il est important de noter qu'un résultat de PCR négatif, même après plusieurs tentatives, ne prouve pas l'absence d'une espèce donnée. Malgré l'utilisation de contrôles positifs dans les réactions de PCR, les raisons des faux négatifs sont nombreuses, notamment de faibles abondances de cibles, le manque de conditions de réaction de PCR optimisées pour des extractions d'ADN génomique particulières, une mauvaise qualité de l'ADN génomique ou d'autres facteurs méthodologiques qui peuvent avoir empêché une amplification réussie de un échantillon donné. Par conséquent, nous n'avons pas effectué d'analyses statistiques sur les différences entre les magasins.

Nous avons cloné et séquencé des amplicons PCR positifs à partir de réactions spécifiques au genre Legionella , Vibrio et Aeromonas pour obtenir des attributions taxonomiques plus raffinées de pathogènes potentiels. Le séquençage double brin des produits clonés a confirmé la présence des agents pathogènes humains potentiels Vibrio vulnificus, V. cholerae, Legionella pneumophila et Aeromonas hydrophila dans le réservoir E1.

À partir des mêmes aquariums d'eau douce, nous avons également séquencé 93 produits de PCR ciblant le gène de l'ARNr 16S presque pleine longueur ( E. coli positions 27 à 1492), pour comparer ces abondances relatives avec celles basées sur le séquençage 454. Dans cette analyse, seuls 5 phylums ont été découverts, les plus abondants étant les Protéobactéries (60%), suivies par les Fusobactéries (27%), les Bacteroidetes (12%), les Spirochètes (1%) et les Nitrospirae (1%). Étonnamment, 4 genres de pathogènes humains ou poissons potentiels ont également été détectés, dont Aeromonas, Flavobacterium, Plesiomonas et Vibrio .

Diversité Vibrio
Notre expérience d'amplicon Vibrio ciblée a produit 27 OTU Vibrio différentes dans l' ensemble, les deux échantillons du magasin A n'ayant qu'une seule OTU chacun, et avec le plus grand nombre d'OTU provenant du magasin E et représentés par 11 types différents de Vibrio OTU. Le placement phylogénétique de ces OTU dans une version élaguée de l'arbre SILVA ARB 5.1 est illustré dansFigure 4. De toutes les affectations taxonomiques associées à GAST, près de la moitié ont été attribuées à V. cholerae et les autres ont été attribuées à Vibrio sp. ou V. vulnificus . Cependant, étant donné que GAST adopte une approche très prudente pour l'attribution de la taxonomie, il est utile d'examiner la relation entre les souches ou les espèces connues de Vibrio dans l'arbre de référence ARB.

Un fichier externe contenant une image, une illustration, etc. Le nom de l'objet est pone.0039971.g004.jpg
Figure 4
Arbre de référence Vibrio .
Arbre de référence de Vibrio créé à l'aide de séquences d'isolats de la base de données de gènes ARNr SILVA-ARB 16S. Montré en rouge sont les OTU Vibrio de notre série FLX dont la taxonomie GAST appartenait au genre Vibrio . Les OTU rouges sont étiquetées avec les désignations d'espèces, le nombre d'étiquettes et le nombre d'échantillons contenant cette OTU.

Un Vibrio cholerae OTU (distance GAST minimale = 0, distance GAST maximale = 1,3%) identifié dans ARB comme la souche PIM9 (GenBank #: GQ359963 ) était dominant dans tous les magasins. Cette OTU allait du seul Vibrio présent (100% de la communauté Vibrio ) à 13% de la communauté. Le deuxième Vibrio OTU le plus courant était très étroitement lié à un Vibrio sp. cultivé à partir d'un biofilm dans une ferme piscicole [22] . Dans l'un de nos échantillons, cette OTU était dominante, constituant 87% de la communauté Vibrio . Les OTU Vibrio restantes étaient très rares - constituant moins de 1% des membres de la communauté.

Aller à:
Discussion
Diversité microbienne
À notre connaissance, il s'agit de la première enquête à caractériser le microbiome de l'eau associé aux poissons d'aquarium d'ornement d'eau douce dans l'industrie des animaux de compagnie en utilisant des méthodes à haut débit. Deux études antérieures de Raja et al. [5] et Sugita et al. [6]se sont concentrés respectivement sur les systèmes de filtration d'eau douce et l'eau des aquariums marins, mais ont utilisé des approches microbiologiques plus classiques, notamment le séquençage de Sanger, le comptage bactérien et la culture. Dans ces études, les auteurs n'ont récupéré que trois phylums de réservoirs marins (protéobactéries, bactéroïdes et firmicutes) et cinq phylums de réservoirs d'eau douce (protéobactéries, bactéroïdes, firmicutes, nitrospira et actinobactéries). Ces résultats sont similaires à notre bibliothèque de clones d'aquariums d'eau douce qui a récupéré 5 phylums (Protéobactéries, Fusobactéries, Bactéroïdes, Spirochètes et Nitrospirae). En revanche, nos méthodes à haut débit ont produit 30 phylums bactériens. Ce contraste frappant illustre l'utilité de la technologie à haut débit pour caractériser des membres extrêmement rares mais importants d'assemblages bactériens;Tableau 2).

Tableau 2
Espèces bactériennes identifiées dans cette étude qui ont été signalées ailleurs comme pathogènes chez divers hôtes.
Taxonomie OTU identifiée par GAST Nombre d'échantillons positifs Hôtes et environnements de l'opérateur principal * Hôtes qui contractent la maladie Manifestation de la maladie Route de transmission principale
Séquences correspondant aux espèces pathogènes trouvées avec 454 amplicons bactériens universels V3V5 séquencés 341F-926R
Coxiella burnetii (1 OTU) 2 Isolé des milieux aquatiques, mammifères domestiques, oiseaux [53] Humains, bétail, autres mammifères domestiques [53] - [54] Fièvre Q (humains), maladies respiratoires et avortement (bétail) Inhalation de spores [53] - [54]
Flavobacterium columnare (2 OTU) ** 4 Isolé des milieux aquatiques [55] - [56] Poissons d'eau douce [55] , Saprophyte [56] Poissons d'eau douce [55] Columnaris Eau contaminée [56]
Legionella pneumophila (2 OTU) 1 Amibes d'eau douce [57] , sols [58] Humains [59] , protozoaires [57] Maladie des légionnaires, fièvre de Pontiac (Humains) Inhalation de spores [59]
Legionella birminghamensis (2 OTU) 1 Inconnu (amibes d'eau douce présumées, sol) [60] Rare chez l'homme [61] Pneumonie Inhalation de spores [61]
Vibrio cholerae (4 OTU) ** 4 Isolé des milieux aquatiques, zooplancton [62] , insectes [63] , poissons marins, crustacés [64] Humains [62] , poissons marins [35] Choléra (humains), septicémie (poissons) Eau et aliments contaminés [62] , [65]
Vibrio mimicus (1 OTU) 1 Isolés des milieux aquatiques [66] , zooplancton, crustacés, œufs de reptiles [67] Rare chez l'homme [67] La diarrhée Eau et aliments contaminés [62] , [65]
Séquences correspondant aux espèces pathogènes trouvées en utilisant 454 amplicons d'amorces V4 spécifiques de Vibrio 518F-680R séquencés
Vibrio cholerae (12 OTU) 7 Voir au dessus
Vibrio vulnificus (3 OTU) 1 Isolated from aquatic environments, Shellfish [68] Humans [69], Fish, Eels [70] Wound infections (Humans), Septicemia (Fish) Contaminated water and food [62], [65]
Aeromonas schubertii (3 OTUs) 2 Unknown Human [21] Intestinal infection (Humans) Contaminated water and food [62], [65]
Sequences matching pathogenic species found using full length Sanger sequenced 8F-1492R amplicons
Aeromonas veronii ++ N/A Isolated from aquatic environments, Medical Leech symbiont [71] Human [71], [26], Fish [35] Diarrhea (Humans), Epizootic ulcerative syndrome (Fish) Contaminated water and food [71], [72]
Aeromonas hydrophila ++ N / A Isolé des milieux aquatiques [71] Humain [37] , [73] , poisson d'eau douce [35] , nématode [71] Diarrhée (humaine), septicémie hémorragique, pourriture des nageoires (poisson) Eau et aliments contaminés [71] , [72]
Plesiomonas shigelloides N / A Isolé des milieux terrestres et aquatiques, Poissons, Reptiles, Oiseaux, Mammifères [73] - [75] Humains [69] , [73] , poissons d'eau douce [35] Infection intestinale, diarrhée (humains), isolées des individus morbides (poissons) Eau et aliments contaminés [72]
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* Beaucoup de ces espèces ont été isolées à partir d'échantillons environnementaux (par exemple aquatiques ou terrestres), cela n'implique cependant pas qu'elles se divisent activement à l'extérieur d'un hôte.
** Ces espèces ont également été trouvées en utilisant le séquençage complet du gène Sanger de l'ARNr 16S (voir méthodes ).
++ Bien que ces espèces n'aient été trouvées dans aucune des séries de pyroséquençage, le genre Aeromonas a été trouvé à des niveaux élevés. La plus grande résolution des lectures Sanger plus longues permettait probablement une classification au niveau de l'espèce avec des lectures Sanger, mais pas des lectures pyrotag.
Il est difficile de faire des comparaisons directes de nos résultats à haut débit, mais dans les environnements typiques d'eau douce (par exemple, lacs, ruisseaux, etc.) les actinobactéries dominent [23] par rapport aux protéobactéries qui dominaient nos échantillons (Toutes: 52%, Aquicella sp.: 3,8 %, Polynucleobacter cosmopolitanus : 3%, Novosphingobium sp.: 2,6%, Naxibacter sp.: 2,5%, Aeromonas sp.: 2%). Un environnement comparatif plus proche pour nos besoins peut être l'eau du robinet, car les aquariums d'eau douce dans les magasins pour animaux de compagnie / aquarium sont généralement remplis avec de l'eau du robinet traitée. Bien qu'aucune étude publiée sur l'eau du robinet ne soit actuellement disponible, le VAMPS ( http://vamps.mbl.edu) a une collection de 25 échantillons d'eau du robinet de Falmouth, MA. Par rapport à ces données (abondance relative moyenne de l'eau du robinet), nos échantillons d'eau d'aquarium contenaient des populations plus petites de Verrucomicrobia et de cyanobactéries et des populations plus importantes de Bacteroidetes, OD1, Fusobacteria et Spirochetes. Les protéobactéries étaient de loin le phylum le plus abondant dans l'eau du robinet (64%) et l'eau d'aquarium (52%). Nous nous abstenons de faire des comparaisons directes ou de déclarer des différences statistiquement significatives étant donné que ces ensembles de données ont été collectés pour différents projets et ont utilisé une région différente du gène de l'ARNr 16S pour attribuer une taxonomie à chaque lecture, bien que les deux aient utilisé le pipeline d'identification taxonomique GAST.

Les estimations de la diversité alpha étaient similaires à celles rapportées dans la littérature, mais elles varient considérablement en fonction de l'environnement d'eau douce, du niveau d'impact sur l'environnement et de la contribution des transferts de paysage comme le sol à la structure globale de la communauté [24] . Aucun transfert de paysage dans ou hors de nos réservoirs d'échantillons ne se produisait, et la structure de leur communauté bactérienne n'aurait dû être qu'un produit de l'eau utilisée pour remplir les réservoirs, des ajouts alimentaires et de tout matériau arrivant dans les conteneurs d'expédition. La grande variation de la diversité alpha et bêta entre les magasins était donc surprenante. Les échantillons collectés dans le même magasin étaient généralement regroupés étroitement dans les analyses PCA (figure 3), malgré le fait que nous ayons collecté des échantillons dans différents bassins avec une composition en espèces très variable (Tableau 2). De plus, les différences entre les magasins étaient toujours importantes, malgré une source d'eau partagée pour la région de Providence. Cela suggère fortement que les caractéristiques des magasins eux-mêmes - y compris les régimes de nettoyage, le fournisseur de poisson, le type de filtration ou les procédures de manipulation influencent la diversité et la structure communautaire des bactéries dans leurs réservoirs. Malheureusement, ces types de données environnementales contextuelles font défaut, et il nous est donc difficile de tirer des conclusions sur les différences sous-jacentes de qualité de l'eau entre nos magasins, qui peuvent refléter des différences dans la composition de la communauté. Des recherches plus poussées incluant ce type de métadonnées pourraient faire la lumière sur les techniques d'élevage utilisées par les animaleries ou les distributeurs auprès desquels les poissons sont achetés, favoriser la santé des poissons et des environnements d'aquarium, et lesquels ne le font pas.

Agents pathogènes potentiels
Notre enquête a identifié 53 genres contenant des espèces potentiellement pathogènes ( tableau S3 ) et onze espèces connues pour causer des maladies chez les poissons, les humains et d'autres espèces (Tableau 2). Cependant, la taxonomie basée sur l'ARNr 16S ne fournit pas la résolution nécessaire pour faire la distinction entre les organismes inoffensifs et virulents, qui peuvent souvent avoir une structure primaire identique le long d'une grande partie de la molécule. Nous ne pouvons donc que commenter la présence potentielle d'une souche virulente au sein de nos échantillons, en fonction de la présence de sa taxonomie supérieure. C'est pourquoi nous les appelons des agents pathogènes potentiels. Il est important de noter que le rôle des éléments génétiques mobiles dans l'écologie de la virulence est encore mal compris [25] , mais il existe des preuves que des transferts en une seule étape de grands fragments d'ADN peuvent se produire rapidement au sein d'une espèce [26], établissant potentiellement la virulence dans une souche formellement inoffensive. Il est donc raisonnable de supposer que la détection d'une espèce pathogène, même si elle n'est pas résolue au niveau de la souche, représente un risque potentiel de maladie.

La discussion approfondie de chacun de ces agents pathogènes potentiels dépasse le cadre de cet article, bien qu'un certain contexte soit justifié. De nombreuses espèces dansTableau 2sont généralement considérés comme infectant les poissons ou d'autres animaux de façon opportuniste, et les maladies ultérieures se développent généralement chez les poissons d'ornement et d'aquaculture lorsque les animaux sont stressés. Bien que rares, les menaces de maladie primaire pour l'homme par les poissons d'ornement résultent souvent de l'ingestion accidentelle d'eau contaminée du réservoir ou de l'introduction de bactéries pathogènes par des plaies ouvertes [27] - [29] . Les menaces bactériennes courantes identifiées dans la littérature semblent être les infections à Mycobacterium , Salmonella, Aeromonas et Legionella chez les enfants, les femmes enceintes et d'autres populations immunodéprimées [29] - [32] .

Parmi les agents pathogènes potentiels des poissons identifiés dans cette enquête, les espèces Aeromonas et Vibrio représentent les menaces les plus importantes pour les poissons d'ornement. Ces bactéries sont toutes des habitants communs de poissons et de systèmes aquatiques sains qui peuvent devenir pathogènes et entraîner une mortalité importante lorsque les conditions sont stressantes [33] - [35]. Le rejet de bactéries pathogènes provenant de poissons stressés, morbides et morts dans le transport (pendant le transport) et dans l'eau d'aquarium partagée par d'autres animaux exacerbe le risque de maladie dans le commerce des poissons d'ornement et préoccupe particulièrement l'industrie. Les maladies causées par ces espèces peuvent survenir dans des conditions normales de réservoir, mais les épidémies sont plus fréquentes lorsque les poissons sont stressés par une faible teneur en oxygène, une teneur élevée en ammoniac, une forte teneur en nitrate, une température de l'eau élevée, une manipulation brutale, des blessures mécaniques et généralement un surpeuplement [33] - [34 ] . Le genre Aeromonascomprend plusieurs espèces qui causent certaines des infections bactériennes les plus courantes chez les poissons d'eau douce qui provoquent fréquemment des hémorragies externes, des abdomens distendus et des yeux saillants, et bien que les taux de mortalité soient généralement faibles (<10%), de nombreuses souches résistent aux antibiotiques couramment utilisés, ce qui permet de lutter pour l'industrie difficile [36] . Les épidémies d' Aeromonas chez les poissons d'ornement peuvent presque toujours être liées à une eau de mauvaise qualité et à une manipulation brutale. A. shubertii, A. veroni et A. hydrophila peuvent provoquer des infections de plaies chez l'homme, une gastro-entérite chez des individus sains et une maladie systémique opportuniste chez des individus immunodéprimés [36] .

Les vibrions sont généralement associés aux environnements marins et saumâtres, mais sont parfois détectés dans les poissons et les environnements d'eau douce, comme ils l'ont été dans cette étude. Les infections à Vibrio peuvent se propager rapidement lorsque les poissons sont confinés dans des systèmes commerciaux fortement peuplés où la morbidité peut atteindre 100% dans les installations touchées [35] , [37] . V. vulnificus est l' infection à Vibrio dérivée du poisson la plus courante chez l'homme, avec une exposition résultant en grande partie de blessures par perforation et d'ingestion, et des signes cliniques se manifestant par une fasciite nécrosante, un œdème et un gonflement au site de ponction [37] . V. cholerae est peut-être le plus largement reconnu des Vibrioespèces, affectant chaque année des millions de personnes dans le monde, principalement dans les pays tropicaux en développement. Les infections à V. cholerae résultent de l'ingestion d'eau contaminée ou via des crustacés infectés et> 100 millions de bactéries sont nécessaires pour provoquer la maladie chez un individu en bonne santé, bien que cela soit beaucoup moins important chez les populations immunodéprimées et les enfants. Des vibrions ont déjà été identifiés dans les aquariums, bien qu'aucune cause de maladie humaine n'ait été rapportée [38] - [40] . Dans notre étude, la prévalence de V. cholerae parmi nos OTU Vibrio détectées est remarquable. V. cholerae (non-O1) a été détecté chez des poissons rouges malades [41], la carpe commune, le cichlidé, le tilapia et le mulet [42] . Bien qu'il y ait des rapports de vibrions causant des maladies chez les poissons, certains rapports suggèrent qu'ils peuvent aider à la digestion des poissons et sont bénéfiques pour l'intestin des poissons [42] .

Directions futures
Nos résultats, combinés aux preuves issues de la littérature, suggèrent que les poissons d'ornement et l'eau des aquariums sont un système sous-étudié avec des communautés microbiennes très diverses et des sources de pathogènes potentiels d'intérêt pour l'industrie des animaux de compagnie et la santé publique. Bon nombre des bactéries potentiellement pathogènes découvertes dans notre enquête ne peuvent être éradiquées car elles font partie de la flore microbienne normale d'une myriade d'hôtes et d'environnements aquatiques. Et, comme décrit ci-dessus, ils ne sont pas toujours nocifs. Néanmoins, des risques existent et nous encourageons donc les propriétaires de poissons d'ornement et l'industrie des animaux de compagnie à assumer la responsabilité de la santé des animaux dont ils ont la charge et des personnes qui en prennent soin. La réduction des risques peut bénéficier d'une science supplémentaire visant à fournir une compréhension plus approfondie de l'écologie microbienne des systèmes d'aquarium et en particulier des pratiques de l'industrie / des consommateurs qui influencent la diversité des communautés microbiennes et facilitent les infections opportunistes. Ces connaissances peuvent être distillées dans des initiatives spécifiques de sensibilisation des consommateurs et de l'industrie. Des lignes directrices ont été établies pour aider à prévenir la salmonellose chez les propriétaires de reptiles (voir celles de l'Association of Reptilian and Amphibian Veterinarians et des Centers for Disease Control) et aider l'industrie à éliminer les tiques porteuses d'agents pathogènes sur les reptiles importés aux États-Unis pour la vente dans le commerce des animaux de compagnie ( Plan national d'amélioration des reptiles du PIJAC). Des programmes similaires peuvent être créés pour les poissons d'ornement, peut-être conformément au programme de certification du Marine Aquarium Council. Les initiatives d'éducation des consommateurs sur le thème des animaux de compagnie en bonne santé atteignent déjà plus de groupes (p. Ex. PetWatch et Healthy Pets Healthy People du CDC), dont certaines incluent des informations sur les poissons d'ornement. Après une série de tentatives politiques infructueuses pour lutter contre les maladies dans le commerce des espèces sauvages[3] , une approche à plusieurs volets qui unit les consommateurs, l'industrie et les scientifiques pour réduire les pathogènes potentiels et les maladies dans la population d'animaux de compagnie du pays, y compris les poissons d'ornement, semble être la voie la plus réaliste.

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Méthodes
Sites, espèces et prélèvement d'échantillons
Sur une période de deux jours en novembre 2009, nous avons acheté des poissons rouges communs d'eau douce ( Carassius auratus ) et des mangeurs d'algues chinoises ( Gyrinocheilus aymonieri ) dans sept animaleries de la région de Providence au Rhode Island. Deux magasins représentaient des chaînes nationales et cinq étaient des petites entreprises locales. Nous avons acheté deux individus de chaque espèce dans six magasins et deux autres mangeurs d'algues chinoises dans un magasin. Chaque individu était associé à un seul réservoir (ce qui a donné 14 réservoirs échantillonnés). Les employés du magasin ont collecté des poissons et de l'eau et ont ensaché les individus d'une seule espèce (deux individus par sac) avec ∼300 à 500 mL d'eau du réservoir. Nous avons immédiatement transporté des sacs à l'Université Brown à Providence, RI pour traitement.

Nous avons filtré manuellement les échantillons d'eau pour concentrer la biomasse microbienne dès leur arrivée au laboratoire. Des seringues stériles de 60 ml ont été utilisées pour transférer l'eau directement des sacs en plastique sur des unités de filtration Sterivex de 0,2 um (Millipore, Billerica, MA). Nous avons filtré un total de 600 ml d'eau par sac de sorte que chaque filtre correspond à un seul réservoir dans un seul magasin, ce qui donne 14 échantillons filtrés. L'air poussé à travers chaque filtre trois fois a servi à éliminer toute eau résiduelle. Une fois la filtration terminée, nous avons placé les cartouches filtrantes immédiatement sur de la glace sèche et les avons stockées congelées à -80 ° C jusqu'au transport sur glace sèche vers le MBL à Woods Hole pour un traitement ultérieur. Après l'échantillonnage, l'un des auteurs a gardé les poissons comme animaux de compagnie personnels.

Extraction d'ADN
L'extraction d'ADN a suivi les instructions du kit Puregene (Qiagen, Valencia, CA) avec les modifications suivantes. Nous avons retiré le filtre à l'intérieur du sterivex à l'aide d'un coupe-tube en PVC stérilisé. Nous avons ensuite utilisé une lame de rasoir stérile pour couper le filtre en deux moitiés et placé chaque moitié dans un tube à bouchon à vis contenant du tampon de lyse Puregene. La lyse cellulaire a été accomplie via l'addition d'enzyme lytique et d'incubation de protéinase K suivie d'un battement de billes avec des billes de zirconium de 0,1 mm (produits Biospec # 11079101z). Nous avons battu les cellules à 5000 tr / min pendant 60 secondes en utilisant un Beatbeater 8 (Biospec Products, Bartlesville, OK). Le reste du protocole a suivi les instructions du fabricant. Les protocoles de filtration de l'eau et d'extraction d'ADN sont disponibles en téléchargement sur http://amarallab.mbl.edu .

Criblage par PCR et clonage d'agents pathogènes potentiels
Nous avons utilisé des amorces de diagnostic PCR pour déterminer la présence ou l'absence de 9 genres bactériens et 4 eucaryotes qui contiennent des agents pathogènes humains communs dans nos 14 échantillons de réservoirs d'aquarium d'eau douce provenant des 7 animaleries étudiées. Nous avons basé notre sélection d'amorces sur des rapports déjà publiés ou une communication personnelle et ciblé le gène de l'ARNr 16S bactérien, le gène de l'ARNr 18S eucaryote ou les gènes codant pour des protéines impliqués dans la pathogénicité (voir le tableau S2 pour plus de détails sur les amorces et les citations). Nous avons confirmé la qualité de l'ADN matrice pour la PCR en réalisant le gène de l'ARNr 16S bactérien en utilisant les amorces générales 27F et 1492R et les amplifications du gène de l'ARNr 18S eucaryote en utilisant les amorces universelles EukA et EukB ciblant respectivement les extrémités 5 'et 3 du gène de l'ARNr 18S [43] .

Les amplifications ont utilisé le kit de PCR Phusion High-Fidelity (Finnzymes, Espoo, Finlande) à une dénaturation à 98 ° C pendant 1 minute suivi de 25 cycles à 98 ° C pendant 5 secondes, à la température d'hybridation de l'amorce pendant 15 secondes et à 72 ° C pendant 30 secondes , suivi de 5 dernières minutes à 72 ° C. Recuire la température varie en fonction de la température de fusion (T m ) de chaque jeu d'amorces, mais est généralement de 3 ° C au- dessus du plus bas T amorce m . Une amplification n'a été qualifiée de «négative» qu'après plusieurs échecs d'amplification, mais nous reconnaissons que l'absence d'amplification n'est pas une preuve concluante de l'absence. Pour les PCR imbriquées, les amplifications extérieures se sont déroulées dans les mêmes conditions mais ont utilisé 5 cycles de moins.

Nous avons utilisé le kit de clonage TOPO® avec des cellules chimiquement compétentes de la souche Mach1 ™ -T1 R E. coli (Life Technologies, Carlsbad, CA) pour cloner les produits de PCR en suivant les protocoles du fabricant. Nous avons séquencé des produits de PCR clonés sur un séquenceur capillaire Applied Biosystems 3730XL, et édité les lectures résultantes à l'aide d'un script interne pour supprimer les séquences vectorielles et les appels de base de faible qualité. Les alignements des séquences avant et arrière et la relecture des séquences ont été effectués manuellement dans Geneious ver. 5.4 Logiciel [44] . Nous avons évalué les attributions taxonomiques à l'aide de l'algorithme de recherche BLAST [45] . Les séquences et les métadonnées conformes à MIMARKS ont été déposées dans la GenBank du National Center for Biotechnology Information (NCBI) sous les numéros d'accession JX317526 - JX317619.

Séquençage d'amplicon
Des méthodologies de pyroséquençage pour le séquençage d'amplicon du gène de l'ARNr 16S ont été décrites précédemment [7] , [8] , [12] , [46] et ont été réalisées sur 2 échantillons chacun des magasins A, D et E. Brièvement, nous avons amplifié l'ARNr 16S bactérien région hypervariable du gène couvrant la région V3 – V5 en trois exemplaires en utilisant un cocktail de 2 amorces directes à la position 341 du gène ARNr 16S d' E. coli , et un cocktail de trois amorces inverses à la position 926 ( tableau S1 ), donnant des amplicons ∼585 paires de bases en longueur. Nous avons multiplexé nos réactions de séquençage en utilisant des amorces avec un code-barres en ligne de 5 pb entre l'amorce et l'adaptateur Roche 454 A de 19 nt [8] , [12]. Les amplicons et les contrôles négatifs ont été purifiés sur colonne de rotation en utilisant le kit de purification QIAquick PCR (Qiagen, Valencia, CA) et les tailles ont été confirmées sur un Bioanalyzer 2100 (Agilent, Palo Alto, CA) en utilisant un DNA1000 LabChip. Des amplicons purifiés ont ensuite été amenés via emPCR et séquencés sur un pyroséquenceur Roche GS-FLX en utilisant des réactifs GS FLX Titanium Series (Roche Diagnostics, Bâle, Suisse) en suivant les protocoles du fabricant.

Nous avons également effectué des réactions de pyroséquençage séparées en utilisant des amorces spécifiques de Vibrio sur 2 échantillons chacun des magasins A, D et E, et un seul échantillon du magasin B.Notez que cette analyse comprenait un seul échantillon d'un magasin (B) non inclus dans le V3 –V5 exécuter. Cette analyse était destinée à échantillonner en profondeur la diversité de Vibrio , mais les attributions de taxonomie d'amplicon qui en résultaient relevaient largement des gammaprotéobactéries. Les protocoles pour cet essai étaient identiques à ceux décrits ci-dessus, sauf que les amorces ciblaient les régions 518F et 680R d' E. Coli(~ 120 nt) et ont été exécutés en utilisant des réactifs FLX sur le Roche 454-GS-FLX. Les données de séquence conformes à MIMARKS ont été déposées dans les archives normales et de lecture de séquence (SRA) du NCBI sous le numéro d'accès SRP013874, les métadonnées associées se trouvent également dans le tableau S4 .

La bioinformatique
Nous avons traité des lectures brutes via le pipeline VAMPS [46] et avons pris les mesures de contrôle de qualité suivantes pour le titane GS-FLX. Nous avons supprimé les lectures si l'une des conditions suivantes était vraie: (1) nous avons détecté des incohérences de séquence avec le code à barres de 5 nt ou l'amorce proximale attendue, (2) nous avons observé un appel de base ambigu (N) n'importe où dans la lecture, (3) nous n'a pas pu trouver de correspondance avec la région conservée utilisée pour couper toutes les séquences à la même position dans l'alignement du gène de l'ARNr 16S ( 5′-CCCATAGATTAGG-3 ′), (4) si la longueur coupée était inférieure à 375 nt, (5) si le score de qualité moyen était inférieur à 30, (6) si la lecture n'était pas identifiable par GAST comme ayant un pourcentage d'identité d'au moins 70% à un séquence bactérienne et, (7) si la lecture contenait un espace ou une suppression dans l'alignement à la séquence de référence la plus proche de 10 nt ou plus. Les chimères ont été supprimées en utilisant UCHIME [47] et 3% OTU ont été attribuées en utilisant UCLUST tel qu'implémenté dans USEARCH v 5.1 [47] . Les algorithmes GAST (Global Alignment Sequence Taxonomy) attribuent la taxonomie à la lecture la plus abondante dans une OTU comme décrit précédemment [12]. En bref, chaque séquence qui a terminé les étapes de rognage et de filtrage a été soumise à une recherche BLAST contre une base de données locale créée à partir de lectures de haute qualité de l'archive SILVA-ARB [48] . La balise séquencée a ensuite été alignée avec MUSCLE [49] contre ses 100 premiers coups BLAST et la distance GAST à chaque coup a été calculée en ajoutant le nombre d'insertions, de suppressions et de mésappariements sur la longueur totale de l'étiquette. Toutes les séquences de la base de données de référence ont ensuite été interrogées pour des correspondances exactes avec le hit GAST supérieur (pas nécessairement le hit BLAST supérieur), et la classification taxonomique RDP de ces correspondances exactes a été renvoyée. Si les deux tiers des classifications étaient le même identifiant taxonomique, alors cette taxonomie était attribuée à cette étiquette.

Nous avons calculé la diversité alpha en utilisant à la fois la diversité phylogénétique (PD) et les modèles paramétriques les mieux adaptés à l'aide de CatchAll [20] . Avant le calcul de la diversité phylogénétique, nous avons rééchantillonné les données de sorte que tous les échantillons aient un effort d'échantillonnage égal. Rarefaction sous-échantillonne au hasard les tableaux d'abondance des espèces jusqu'au plus petit nombre parmi tous les échantillons, supprimant ainsi l'hétérogénéité entre les échantillons [50] , [51] . La diversité phylogénétique a ensuite été calculée comme la longueur totale minimale des branches phylogénétiques nécessaires pour couvrir tous les taxons dans un échantillon donné sur un arbre phylogénétique [52]. Puisque toutes les séquences d'une étude sont placées dans l'arbre, cette estimation n'est pas influencée par les particularités des algorithmes de clustering de séquences. Nous avons effectué des estimations de raréfaction et de diversité phylogénétique dans Qiime v1.4.0 [19] en utilisant l'estimateur PD Whole Tree.

Nos estimations de la diversité phylogénétique ont montré des preuves solides pour les différences entre les magasins, cependant les estimations de PD sont descriptives, basées uniquement sur un échantillon et ne permettent pas d'extrapolation à une population. Pour fournir ce contexte supplémentaire, nous avons également calculé la diversité alpha en utilisant CatchAll 3.0 [20] . CatchAll calcule une large gamme de modèles à mélanges finis et toutes les estimations connues non paramétriques et paramétriques basées sur la couverture, et présente le modèle qui correspond le mieux à chaque jeu de données, ou le modèle d'ajustement `` le meilleur du meilleur ''. Il fournit également des erreurs standard, la qualité de l'ajustement et des intervalles de confiance pour chaque estimation [20] .

Visualiser la diversité de Vibrio
Bien que la stratégie GAST offre un moyen efficace d'attribuer une taxonomie à nos OTU, elle est assez prudente. Pour affiner davantage la taxonomie Vibrio , nous avons construit un arbre de référence en utilisant des séquences de Vibrio pleine longueur sélectionnées à partir d'isolats publiés dans la base de données ARNr Silva ARB 16S SSU_ref_102. À cet arbre de référence, nous avons ajouté toutes les séquences représentatives OTU renvoyées par GAST avec au moins une affectation taxonomique Vibrionaceae (24 OTU représentant 12 175 séquences) en utilisant la parcimonie à ajout rapide de séquence à arbre d'ARB. Cette méthode nous a permis de visualiser la diversité de nos OTU Vibrio indépendamment des affectations GAST (Figure 4)."

Ce sont des traductions automatiques, donc pas forcément parfaites désolé...
En gros il y a des agents potentiellement pathogènes type choléra, çà rassure... Mais çà va permettre de voir comment çà fonctionne dans les cuves en regardant les différentes espèces...
A suivre donc! :fou:

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Re: Maladie ou toxicité ?

Message par philB » 05 Oct 2020, 07:17

Sinon j' ai une autre solution 😜
On prend ton texte Jérôme, on l'imprime on le met a fondre dans le bac...et nul doute que les méchants organismes mourront d indigestion 😂😂

Plaisanterie mise a part merci pour cet épatant et important travail de recherche !! 👍
Il faut juste que je prenne le temps de le lire vraiment attentivement car il amène réflexion 🙂
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Re: Maladie ou toxicité ?

Message par ccdrik56 » 06 Oct 2020, 21:49

Je reviens vers vous pour vous tenir informé de l'évolution.
Déjà merci pour votre aide!
Pour en revenir au deux dernier alto, j'avais réussi à prélevé le dernier, et je l'avais isolé dans un 50L.
Donc il n'est pas mort et ce ralimente.
Pensez vous que si il avait une bactérie ou une toxine, il pourrait s'en remettre aussi facilement?

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Re: Maladie ou toxicité ?

Message par biodivmax » 07 Oct 2020, 07:53

Toxine oui il suffit de ne plus être en contact. Bactérie non probablement pas, sans traitement l'infection aurait continué.

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Re: Maladie ou toxicité ?

Message par Petro91 » 07 Oct 2020, 09:40

C'est la dose qui fait le poison, comme dirait l'autre !! .... (même si cette maxime a été remise en cause bien souvent).

Cette toxine doit être légère et incommodante au point que les poissons en meurent en plusieurs mois. Il s'agit d'un composant troublant leur vie mais non létal.
A présent, l'équilibre de ton bac est à reprendre complètement.
Eric
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Re: Maladie ou toxicité ?

Message par philB » 07 Oct 2020, 14:01

Donc on irait vers l option d une TOXICITÉ

Je propose ( en tant que modérateur 🙂) d examiner entièrement
Cette piste
( Que ceux qui pensent autre chose laissent se dérouler cette hypothèse svp ; quitte a ce qu on change plus tard de direction si ça ne donne rien ! )

Donc ce serait une toxicité très durable ; suffisamment forte pour affaiblir des poissons petits ou gros : Tropheus / Altos etc

1 Qui viendrait de quoi ? La colle ? Des éléments du Décor rocheux? Le sable ? Des supports de filtration ? Autre?

2 Il serait peut être bon que Cédric nous rappelle les références de ces éléments ou nous mette un lien vers un éventuel dossier technique

😉
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Re: Maladie ou toxicité ?

Message par biodivmax » 07 Oct 2020, 15:01

Mon hypothèse reste que cette toxicité vient d'une sécrétion de toxines par des colonies de bactéries disséminées dans les profondeurs du substrat sableux, et qui excrètent probablement une toxine (similaire aux toxines qui donnent des toxi-infections alimentaires chez l'homme quand on mange des fruits de mer ou des œufs pas très frais, et que des Escherischia coli ou des salmonelles les ont contaminé).
Ces bactéries peuvent être des bacilles Gram négatif ( E. coli, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Campylobacter,etc...) c'est à dire des germes d'origine fécale, aéro-anaérobies facultatifs, ou plus probablement des anaérobies stricts comme des Clostridium (l'agent du botulisme, que je verrai bien en cause ici).
L'idée est donc de transformer les populations bactériennes de la cuve pour éliminer ou restreindre l'évolution de ces colonies toxiques, donc soit en diminuant l'épaisseur du sable, soit en favorisant sa bioturbation (introduction de Melanoides), soit en augmentant l'oxygénation du substrat (brassage important, oxydator, ozoniseur, augmentation des débits de filtration), soit en concurrençant les colonies bactériennes par d'autres souches ( Traitement antibiotique type flagyl puis élimination de l'antibiotique et apport massif de bactéries du commerce, soit déjà spécifiquement pour aquarium, soit même pour fosse septique), et éventuellement en combinant toutes ces solutions.
L'identification des bactéries en cause par un laboratoire de biologie serait un plus, à voir peut-être avec un vétérinaire pour organiser des prélèvements...
Vous remarquerez que toutes les solutions évoquées par les uns et les autres sont citées, car toutes peuvent concourir à l'amélioration du système...
En résumé je pense que tout le monde avait raison... un peu, mais sans aller au bout du raisonnement!

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